Izolace buněčných jader z listů Arabidopsis thaliana - jedná se o standardní metodu ke získání DNA a jiných jaderných komponentů. Tento proces se skládá z několika kroků, jejichž optimalizací lze dosáhnout standardního výtěžku požadované jaderné složky. Jednotlivými kroky jsou homogenizace, odstranění nejaderných balastů, promytí a lýza jader.
1. Homogenizace a lýza buněčné stěny
editovat
Cílem tohoto procesu je rozdrcení rostlinné tkáně a rozbití vyšších rostlinných struktur, aby došlo k uvolnění jednotlivých buněk. Zároveň musí být tento proces šetrný, aby nepoškodil samotné buňky. Metod homogenizace je několik např.:
- mechanická,
- enzymatická,
- osmotická.
U rostlinných tkání se nejvíce osvědčila homogenizace mechanická. Za pomocí tekutého dusíku jsou listy zmraženy a za přilévání dusíku do třecí misky drceny. Nejúčinnější homogenizace je ve chvíli, kdy se dusík odpaří, ale je třeba dbát na to, aby nedošlo k zahřátí vzorku, proto bez dusíku třeme co nejkratší chvíli a znovu dusíkem zchladíme. Dusík přiléváme opatrně, aby nedošlo ke ztrátě vzorku. Snažíme se třít co největší silou, pro co nejlepší výtěžek jader. Po dostatečné homogenizaci přeneseme vzorek (nejčastěji vychlazenou plastovou lžičkou) do lyzačního roztoku. Jedná se o roztok, který rozbije buněčné stěny a uvolní buněčné komponenty vč. Jader do roztoku. Lyzačních roztoky jsou různé, většinou obsahují sůl (NaCl, KCl), kyselinu (EDTA), sacharózu, dále se liší dle použitého protokolu.[1] [2]
Po lýze buněk dostáváme roztok obsahující směs veškerých proteinů a složek tkáně listů. Je třeba odstranit co nejvíce těch složek při zachování jader. Složení promývacích roztoků se liší podle použitého protokolu, obsahují však vždy detergent solubilizující membránové proteiny (Triton X-100[3], Tween, aj.). Při promývání můžeme již pouhým okem vidět, jak vzorek bělá – odstraňuje se chlorofyl a cytosolické složky a vzniká nám bílý pelet, obsahující hlavně jádra ale stále i další proteiny. Velmi výhodným krokem je použití Percollového pufru. Percoll způsobuje flotaci jader, proto po centrifugaci nacházíme jádra na hladině a ostatní balasty na dně zkumavky. Jádra opatrně sebereme do další zkumavky.[4]
Jádra je nutné promýt, pro odstranění detergentů, které by při další analýze interferovaly nebo pro odstranění Percollu z téhož důvodu. Promytí probíhá opět pomocí roztoků, které se mohou lišit pouze tím, že neobsahují detergent, použitý při odstranění balastů. Po promytí jader bychom měli získat pelet čistých jader připravených k dalšímu zpracování nebo zamražení pro použití později. Pokud zamrazujeme je třeba jádra resuspendovat v promývacím purfu a smísit 1:1 s glycerolem, dobře promísit a ihned zmrazit v tekutém dusíku a následně uchovat při -80 °C. [5]
Čerstvá nebo rozmražená jádra po odstranění glycerolu je nutné lyzovat, jinak bychom se přes jadernou membránu nepropracovali k námi požadovaným proteinům. Lýza jaderné membrány by měla být co nejšetrnější, abychom nepoškodili proteiny. Po lýze dostáváme směs jaderných proteinů a fragmentů jaderné membrány. Následují specifické postupy extrakce, závisející na druhu proteinů, které chceme získat, př. Rotace peletu resuspendovaném v 0,2M H2SO4 po dobu 16 h pro extrakci jaderných histonů.
| Lýza buněčné stěny: Pufr A
|
| 10mM MES pH 6.0
|
| 5mM EDTA
|
| 10mM NaCL
|
| 250mM sacharóza
|
| 0,6% Triton X-100
|
| 150 uM spermidin
|
| 100 uM PMSF
|
| 20 mM merkaptoetanol
|
| Lýza buněčné stěny: Lysis Buffer (LB)
|
| 20 mM Tris-HCl, pH 7.4 2 ml (1 M)
|
| 25% Glycerol 25 ml
|
| 20 mM KCl 1 ml (2M)
|
| 2 mM EDTA 0.4 ml (0.5M)
|
| 2.5 mM MgCl2 0.25 ml (1M)
|
| 250 mM Sucrose 12.5 ml (2M)
|
| Add H2O to 100ml
|
| Add DTT and PMSF to a final concentration of 1mM respectively, immediately before use
|
| Odstranění balastů: Pufr B
|
| 2,4 g pufru 5xA
|
| 18g Percoll
|
| Těsně před použitím se přidá:
|
| 14,2 ul merkaptoetanolu
|
| 40ul 0,1M PMSF
|
| Odstranění balastů: Nuclei Resuspension Buffer with 0.2%Tition-X100 (NRBT)
|
| 20 mMTris-HCl, pH 7.4 2 ml (1M)
|
| 25% Glycerol 25 ml
|
| 2.5 mM MgCl2 0.25 ml (1M)
|
| 0.2% Triton X-100 0.2 ml
|
| Add H2O to 100ml
|
| Promytí jader: Pufr C
|
| 10mM Tris-Cl pH 7,7
|
| 100mM síran amonný
|
| 10mM MgCl2
|
| 5mM merkaptoetanol
|
| Promytí jader: Nuclei Resuspension Buffer (NRB)
|
| 20 mMTris-HCl, pH 7.4 2 ml (1M)
|
| 25% Glycerol 25 ml
|
| 2.5 mM MgCl2 0.25 ml (1M)
|
| Add H2O to 100ml
|
| Lýza jader: Lyzační pufr
|
| 100 mM NaCl
|
| 3 mM EDTA
|
| 50 mM Tris-Cl, pH = 8
|
| 1 % CHAPS
|
| Inhibitory proteáz
|
| Lýza jader: Lyzační pufr s močovinou
|
| 8 M urea
|
| 150 mM NaCl
|
| 50 mM Tris-Cl, pH = 7,5
|
| 5 mM DTT
|
- ↑ Protein Analysis/Proteomics. In: Protein Analysis/Proteomics [online]. 2006 [cit. 2014-05-22].
- ↑ BERGMÜLLER, Eveline, Peter M. GEHRIG a Wilhelm GRUISSEM. Characterization of Post-Translational Modifications of Histone H2B-Variants Isolated from Arabidopsis thaliana. Journal of Proteome Research [online]. 2007, vol. 6, issue 9, s. 3655-3668 [cit. 2014-05-22]. DOI: 10.1021/pr0702159. Dostupné z: http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/pr0702159
- ↑ Triton X-100. In: Wikipedia: the free encyclopedia [online]. San Francisco (CA): Wikimedia Foundation, 2001- [cit. 2014-05-22]. Dostupné z: http://en.wikipedia.org/wiki/Triton_X-100
- ↑ CLP – ANALYSIS OF MOLECULAR MARKERS: DNA ISOLATION, RAPD, AFLP, PCR-RFLP – CZECH VERSION. In: CLP – ANALYSIS OF MOLECULAR MARKERS [online]. 2007 [cit. 2014-05-22].
- ↑ Izolace buněčných jader z rostlinných tkání. In: Izolace buněčných jader z rostlinných tkání [online]. 2008 [cit. 2014-05-22].
